Alla nascita le concentrazioni plasmatiche di fenilalanina sono solitamente normali, ma aumentano rapidamente con l'inizio dell'alimentazione contenente proteine e, di solito, sono anormali a partire dal quarto giorno. Poiché, se si vuole prevenire il ritardo di sviluppo, la diagnosi e l'inizio del trattamento dietetico della fenilchetonuria classica devono essere eseguiti prima che il bambino compia 30 giorni, nel Nord America e in Europa la maggior parte dei neonati viene sottoposta alla determinazione delle concentrazioni ematiche di fenilalanina per mezzo del test di inibizione batterica di Guthrie. I piccoli con valori anormali sono seguiti ulteriormente con dosaggi fluorometrici o cromatografici più precisi dal punto di vista quantitativo. Nella fenilchetonuria classica. In qualsiasi bambino affetto da iperfenilalaninemia che, malgrado una pronta diagnosi e un inizio immediato del trattamento dietetico, sviluppi un danno neurologico progressivo, si deve prendere in considerazione un deficit di tetraidrobiopterina. Queste varianti che colpiscono dall'1 al 5% dei bambini fenilchetonurici, possono essere diagnosticate mediante un dosaggio enzimatico su colture di fibroblasti. La somministrazione orale di carichi di tetraidrobiopterina può fare distinguere i bambini con feniichetonuria classica (che non mostrano una risposta chimica) da quelli con deficit di tetraidrobiopterina (che presentano una brusca caduta della fenilalanina piasmatica). La diagnosi prenatale della fenilchetonuria classica è attualmente possibile impiegando le analisi, basate sul DNA, in grado di rilevare mutazioni specifiche oppure polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (linked restriction fragment length polymorphisms, RFLP). Il deficit della diidropteridina reduttasi e i blocchi nella sintesi di tetraidrobiopterina possono essere rilevati in utero impiegando analisi su ainniociti in coltura.

La fenilchetonuria classica è la prima malattia metabolica ereditaria in cui fu dimostrato che la prevenzione dell'accumulo del metabolita nocivo previene le gravi conseguenze cliniche. Ciò è reso possibile da una dieta speciale nella quale si sostituisce la maggior parte delle proteine con una mistura artificiale di aminoacidi a basso contenuto di fenilalanina. Supplementando questa mistura con piccole quantità di cibo naturale, viene fornito con la dieta un apporto di fenilalanina sufficiente per una crescita normale, ma che non origina livelli ematici di fenilalanina marcatamente aumentati. Tale dieta deve essere istituita durante il primo mese di vita. Perfino in questo caso, sono spesso osservabili modeste alterazioni del sistema nervoso. Poiché l'iperfenilalaninemia non controllata causa danni cerebrali durante l'infanzia (e forse nell'età adulta), la restrizione dietetica dovrebbe essere mantenuta indefinitamente.